Патент bacillus subtilis

штамм бактерий b. subtilis — продуцент сурфактина

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Штамм Bacillus subtilis 0017 выделен из образца типичного чернозема Республики Башкортостан и поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Регистрационный номер в коллекции — 0017. Штамм превосходит по уровню накопления сурфактина известные природные штаммы. 1 табл., 4 ил.

Рисунки к патенту РФ 2270858

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Его практическое применение возможно в нефтедобывающей промышленности для увеличения извлечения нефти из нефтеносных пластов [1], при очистке емкостей от остатков нефти, очистки загрязненной углеводородами почвы, для стабилизации и дестабилизации эмульсий [2, 3], а также в качестве биологически активного компонента фармпрепаратов.

Это вещество, согласно описанию Kakinuma et al. [4, 5], представляет собой смесь циклических гексапептидов, замкнутых в кольцо через -гидрокси жирную кислоту с углеродной цепью из 13-15 атомов:

Сурфактин обладает множественной биологической активностью. Он способен лизировать эритроциты [6] и протопласты бактерий [7]. Кроме того, сурфактин ингибирует реакцию фибриноген-тромбин, замедляя образование фибрина [8]. Это свойство определяет его как возможный компонент при создании противокоагулирующих средств для профилактики тромбозов и для предотвращения болезней типа инфаркта миокарда, легочной эмболии и т.д.

Сурфактин проявляет антихолестеразную активность, снижая уровень холестерина в плазме и печени [9], обладает противоопухолевой [10], фунгицидной и антибиотической активностями [11]. Данный липопетид проявляет бактериостатические свойства даже при концентрациях 5-10 ppm.

Сурфактин является сильным поверхностно-активным соединением, при концентрации 0,05% поверхностное натяжение воды снижается с 72 мН/м до 27 мН/м [8].

Множественность полезных физико-химических, биологических и физиологических свойств этого вещества свидетельствует о том, что оно может широко использоваться в фармацевтике, технических и природоохранных областях.

Arima, К et al. [8] описал метод получения сурфактина, основанный на использовании природных штаммов бактерий B.subtilis ATCC 21331 или АТСС 21332. Однако эти штаммы обеспечивали выход не более 0.05-0.1 г/л сырого продукта и 0.04-0.05 г/л очищенного вещества, что экономически оказалось невыгодно.

Для повышения выхода сурфактина в процессах ферментации были предложены решения, основанные на подборе состава питательных сред, изменении технологических схем или на получении мутантных штаммов уже известного продуцента B.subtilis ATCC 21332.

Путем добавления в базовую питательную среду гидролизата торфа Sheppard J. and Mulligan С. [12] добились выхода 0,16 г/л сурфактина, используя известный продуцент.

Cooper D.G. et al., [13] предложили технологию получения сурфактина с помощью известного штамма B.subtilis ATCC 21332, основанную на непрерывном отборе пены из ферментера. Реализация данного решения позволила достичь выхода сурфактина 0,7-0,8 г/л.

Mulligan et al. [14] путем ультрафиолетового облучения известного продуцента B.subtilis ATCC 21332 получили мутант B.subtilis ATCC 53813, в 3,4 раза превосходящий исходный по продуктивности.

Carrera et al. [15, 16], используя в качестве мутагена N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин, получили из известного B.subtilis ATCC 21332 новый мутант B.subtilis ATCC 55033, обеспечивающий выход от 1,2 до 2,0 г/л сурфактина с чистотой 99%.

Ohno et al. [17] с помощью рекомбинантной плазмиды рС112 получили штамм Bacillus subtilis MI 113, превосходящий по продуктивности дикий штамм в 1,5 раза. Однако накопление сурфактина при глубинном культивировании не превышало 0,4 г/л, но при твердофазной ферментации этого рекомбинантного штамма на среде с коагулятом сои «Okara» в качестве субстрата продуктивность возросла до 2,0 г/кг сырого веса среды [18].

Основным недостатком известных рекомбинантных штаммов является недостаточная стабильность плазмид, несущих ген, регулирующий биосинтез сурфактина. К другим недостаткам следует отнести законодательные ограничения на применение генетически модифицированных микроорганизмов в природных условиях и фармацевтике, существующие в большинстве развитых стран.

В научных публикациях имеются данные о природных («диких») штаммах B.subtilis S 499 (продуктивность 110 мг/л) [19] и B.subtilis RB 14 (продуктивность 250 мг/л) [17], однако, их недостатком является сопродукция антибиотика итурина, который крайне сложно отделить от целевого продукта.

Цель настоящего изобретения — получение природного, генетически неизмененного штамма почвенных бактерий, превосходящего по уровню накопления сурфактина известные природные («дикие») штаммы.

Поставленная цель достигается предлагаемым штаммом Bacillus subtilis ИБ-17, выделенным из образца почвы типичного чернозема, отобранного на территории республики Башкортостан (Российская Федерация). Штамм поддерживается в Коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии Института биологии Уфимского научного центра РАН. Номер штамма в коллекции 0017 (ИБ-17).

Культурально-морфологические признаки. Спорообразующие, грамотрицательные, палочковидные подвижные клетки размером 0,9-1,7 на 5,6-9,9 мкм. Спорангий не раздувают, расположены субцентрально. На среде с мясопептонным агаром на 1 сутки образует колонии: овальные, диаметром 1,0-1,5 мм, плоские, непрозрачные, блестящие, кремового цвета. На седьмые сутки роста около 80% колоний разрастаются в размерах до 4-8 мм и приобретают неправильную форму за счет вторичного веерообразного разрастания исходной колонии. У колонии края приобретают ярко выраженный лопастной вид с незначительным бортиком по краям, где сохраняется исходный цвет и непрозрачность. Тогда как сама колония становится полупрозрачной, структура ее не однородная, в центре крупнозернистая с включением не прозрачных глыбок.

Физиологические признаки. Отношение к кислороду — строгий аэроб. Светонезависим. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45°С. Минимальная температура 10°С, максимальная 50°С. Растет в интервале рН от 4,5 до 9,0, оптимально — при рН 7,5. Галотолерантность характеризуется ростом при 7% NaCl. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Дезаминирование фенилаланина не происходит. Разлагает тирозин и использует цитрат. Проявляет гемолитическую активность — гемолиз, кислород независимый.

По совокупности физиолого-биохимических признаков штамм принадлежит к семейству Bacillaceae и относится к роду Bacillus, виду subtilis [20].

Состав среды для культивирования, мас.%: крахмал — 1; пептон — 0,5; дрожжевой экстракт — 0,3; кукурузный экстракт — 0,3; К2HPO4 — 0,2; (NH4 )2SO4 — 0,2; вода водопроводная — до 100. Штамм хранится на косяках картофельного агара или в лиофильно высушенном состоянии.

Образование заявляемым штаммом поверхностно-активного вещества — сурфактина характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Поверхностно-активные свойства. Предлагаемый штамм Bacillus subtilis ИБ-17 выращивают в колбах объемом 250 мл со 100 мл питательной среды на качалке УВМТ-12 при 37°С и n=160 мин -1 в жидкой питательной среде следующего состава, г/л дистиллированной воды:

www.freepatent.ru

Штамм бактерий bacillus subtilis для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов

Владельцы патента RU 2553518:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus subtilis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под номером RCAM01729 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств защиты растений от экономически значимых болезней. 7 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения бактериального препарата против болезней сельскохозяйственных культур, вызываемых фитопатогенными грибами рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, Puccinia и Phoma.

Известны штаммы Bacillus subtilis, предназначенные для защиты растений от грибных и бактериальных патогенов. Например, штаммы Bacillus subtilis В-14, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий (Патент РФ №2337955, кл. C12N, C12R, опубл. 10.11.2008), Bacillus subtilis 11 В, обладающий широким спектром антагонистической активности (Патент РФ №2182172, кл. C12N, А61К, опубл. 10.05.2002) и Bacillus subtilis M1, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью (Патент РФ №2307158, кл. A01N, C12N, C12R, опубл. 27.09.2007). Однако нет данных об антифунгальной активности указанных штаммов в отношении таких экономически значимых болезней как желтая пятнистость листьев (Pyrenophora tritici-repentis), снежная плесень (Microdochium nivale (F.nivale) и бурая ржавчина (Puccinia recondita f. sp. tritici). Кроме того, отсутствуют сведения о совместимости (устойчивости) этих штаммов с химическими препаратами, используемыми в системе интегрированной защиты сельскохозяйственных культур.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, являющийся основой биопрепарата «Фитоспорин» (Патент РФ №2099947, кл. A01N, C12N, C12R, опубл. 27.12.1997). Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов.

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов, позволяющего расширить арсенал средств защиты растений от экономически значимых болезней.

Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus subtilis BZR 336g, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. Новый штамм выделен из ризопланы растения озимой пшеницы Крыловского района Краснодарского края (тип почвы чернозем обыкновенный, тяжелосуглинистый, малогумусный) и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ), г. Санкт-Петербург, под номером RCAM01729. Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, стимуляция роста растений, отсутствие фитотоксичности и патогенности к теплокровным животным. Идентифицирование штамма проводилось с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки палочковидные с закругленными концами, одиночные или соединены попарно, клетки подвижны, размеры 0,46-0,75×1,42-1,92 мкм. Имеются споры. На сухом питательном агаре для культивирования микроорганизмов форма колоний ризоидная с неправильным или лопастным краем. Колонии блестящие, бесцветные. Профиль колоний плоский, структура — мелкозернистая, консистенция мягкая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 3-8 мм.

На картофельно-глюкозном агаре формируются колонии ризоидной формы с лопастным краем. Колонии матовые, кремово-желтого цвета. Профиль колоний изогнутый, структура — крупнозернистая в центре, мелкозернистая по краю, консистенция мягкая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 4-9 мм.

Температурный оптимум роста +28-+35°С, оптимум рН — 6,0-8,0. В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Продуцирует гидролитические ферменты группы протеаз и липаз. В качестве источника углерода активно использует мелассу, средне усваивает глюкозу, сахарозу, глицерин. Использует пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты в качестве источника азота.

Чистая культура штамма Bacillus subtilis BZR 336g хранится в пробирках на скошенной агаризированной питательной среде (картофельно-глюкозный агар или сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов). Температура хранения +4-+8°С. Срок хранения 12 месяцев. Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (г, мл/л): панкреатический гидролизат кильки — 17,9; агар микробиологический — 11,2; NaCl — 7,7. Картофельный агар (г, мл/л): глюкоза — 20,0; агар микробиологический — 20,0; картофельный отвар (из расчета 500 г очищенного и измельченного картофеля на 1000 мл водопроводной воды) — 1000. Инкубация при температуре +28-+30°С, продолжительность выращивания — 2-3 суток.

Установлено, что штамм Bacillus subtilis BZR 336g обладает антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов из родов Fusarium, Microdochium, Pyrenophora (таблица 1).

Определение антифунгальной активности бактериальных штаммов проводили методом двойных (встречных) культур на картофельно-глюкозном агаре. В чашки Петри высевали агаровый блок с мицелием патогена, бактериальный штамм при этом наносили методом штриха на расстоянии 6 см от блока патогена. Культуры инкубировали в течение 20 дней при температуре +28°С. Контрольные варианты — чистые культуры гриба патогена и бактерии, посеянные отдельно. Учеты проводили на 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки. Отмечали характер взаимоотношений гриба и бактерии: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия патогена. Степень ингибирования роста мицелия патогена определяли по формуле

где И — % ингибирования;

А — рост гриба в варианте;

В — рост гриба в контроле.

Штамм Bacillus subtilis BZR 336g активно ингибировал рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Microdochium nivale (F.nivale), Pyrenophora tritici-repentis (таблица 1).

Отмечены существенные морфологические изменения патогенных грибов под воздействием вторичных метаболитов бактериального штамма Bacillus subtilis BZR 336g: отсутствие воздушного мицелия, лизис и израстание уже сформировавшегося мицелия, ингибирование роста и потемнение мицелия патогена.

Для оценки ростостимулирующей активности штамма Bacillus subtilis BZR 336g семена озимой пшеницы сорта Калым обрабатывали жидкой двухсуточной культурой. Через 24 ч обработанные семена высевали в почву в условиях открытого грунта. Повторность опыта трехкратная. Производили учет длины и массы корня и побега проростков на различных этапах вегетации. Корни проростков предварительно тщательно отмывали от почвы.

В результате предпосевной обработки семян озимой пшеницы жидкой культурой штамма бактерии Bacillus subtilis BZR 336g на ранних этапах вегетации наблюдалось статистически достоверное увеличение длины корня на 9%, массы корня на 28,0% по сравнению с проростками в контрольном варианте. На более поздних этапах вегетации было отмечено стимулирующее действие на развитие побегов: увеличение длины и массы побега на 11,3 и 51,1% соответственно.

Определение фитотоксичности штамма проводили методом замачивания семян озимой пшеницы в бактериальной суспензии. Для этого культуру штамма выращивали на картофельно-глюкозном агаре. Затем получали суспензию методом смыва стерильной водой. Семена озимой пшеницы замачивали в суспензии на два часа и ставили на проращивание в рулоны из фильтровальной бумаги. Контроль — семена, замоченные в стерильной воде. По количеству проросших семян в контроле и в варианте судили о фитотоксичности штамма.

С целью установления влияния штамма Bacillus subtilis BZR 336g на проростки озимой пшеницы в химические стаканы с бактериальной суспензией помещали проростки озимой пшеницы с подрезанной корневой системой. Контроль — проростки озимой пшеницы, помещенные в стерильную воду. Продолжительность теста 10 дней. По количеству увядших растений в контроле и вариантах судили о фитотоксичности штамма. Повторность во всех опытах трехкратная.

Из таблицы 2 видно, что заявленный штамм Bacillus subtilis BZR 336g не оказывает негативного влияния на энергию прорастания и всхожесть семян, а также не вызывает увядания проростков.

www.findpatent.ru

RU2081175C1 — Штамм bacillus subtilis — продуцент рибофлавина (варианты) — Google Patents

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, конкретно к микробиологическому синтезу рибофлавина.

Рибофлавин (витамин В2) применяется в животноводстве, звероводстве, и птицеводстве (свиньи, куры, пушные звери) в качестве кормовой добавки. Кристаллический рибофлавин используют в пищевой и фармацевтической промышленности.

В мировой практике для получения рибофлавина микробиологическим способом используют грибной продуцент. Известен штамм Eremothecium ashbyii «ВНИИгенетика 1906» [1] который на соевой среде с гидролом и кукурузным экстрактом накапливает за 96 ч роста при 20 o С 1,9 г/л рибофлавина. Главным недостатком грибного продуцента является большая продолжительность процесса ферментации.

Известны штаммы Bacillus subtilis, обладающие сверхпродукцией рибофлавина [2] и характеризующиеся разрегулированным биосинтезом пуринов и рибофлавина, а также инверсией и амплификацией рибофлавинового оперона на хромосоме Bacillus subtilis. При использовании сложных питательных сред, содержащих глюкозу, мальтозу, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, фосфаты калия, глютамат и цитрат натрия, соли Мg ++ , Ca ++ , Mn ++ , Fe +++ , янтарную кислоту и др. а также введения в ферментер углеводной подпитки при помощи компьютера в режиме поддержания определенного уровня растворенного кислорода (15±5) в культуральной жидкости эти штаммы способны накапливать 13-14 г/л рибофлавина за 48 ч и 15 г/л за 56 ч. Недостатком этого процесса является то, что высокие показатели достигаются только при применении дорогих и дефицитных компонентов питательной среды и сложной технологии.

Разработан микробиологический способ получения рибофлавина на основе штаммов Bacillus subtilis ВНИИгенетика 304 и 304а [3] полученных с помощью генетических и селекционных методов, включающих получение мутантов, устойчивых к аналогу рибофлавина-розеофлавину, объединение мутаций по операторной и регуляторной областям с помощью генетической трансформации, ступенчатый отбор с использованием мутагенов. Недостатком этих штаммов является относительно низкий уровень синтеза рибофлавина, достигающий 1,0 г/л.

В авторском свидетельстве СССР N 1429568 [4] описан штамм Bacillus subtilis «ВНИИгенетика 24/рМХ45», созданный на основе штамма Bacillus subtilis «ВНИИгенетика 304а». Этот штамм, рассматриваемый в качестве прототипа, получен генетико-селекционными и генно-инженерными методами, включающими получение регуляторных и других мутантов, конструирование гибридной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон Bacillus subtilis, введение данной плазмиды в реципиентный штамм Bacillus subtilis, обеспечение экспрессии рибофлавинового оперона в составе плазмиды клетки хозяина. При выращивании штамма в глубинных условиях при температуре 37-42 o С и аэрации на среде, содержащей в качестве источников углерода глюкозу или сахарозу, зеленую патоку или мелассу, источников минерального азота мочевину или соли аммония, аммиачную воду, минеральные соли и ростовые факторы, например, сухую биомассу дрожжей, БВК, дрожжевой экстракт, пептон, гидролизат казеина в культуральной жидкости накапливается 6,0 г/л рибофлавина за 48-50 ч роста.

В случае применения способа получения рибофлавина, описанного в авторском свидетельстве СССР N 1561513 [5] достигается увеличение коэффициента конверсии источника углеводов в рибофлавин и снижение количества посторонних примесей в культуральной жидкости. Способ включает культивирование штаммов-продуцентов вида Bacillus subtilis в глубинных условиях при перемешивании и аэрировании на ферментационной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые вещества и минеральные соли, при этом источник углерода в ферментационную среду подают с постоянной скоростью 1-3 г/л в час.

Недостатком штамма-прототипа ВНИИгенетика 24/рМХ45 является относительно невысокая биосинтетическая активность в колбах и в ферментерах с применением описанного выше способа.

Целью изобретения является получение высокоактивного штамма-продуцента витамина В у бактерий вида Bacillus subti- lis.

Поставленная цель достигается получением новых штаммов Bacillus subtilis Биореактор-1 А3, коллекционный номер 2159 и Биореактор-1 ST12, коллекционный номер 2160 в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам (ГНЦА), которые за 72 ч роста при температуре 37-43 o С в условиях перемешивания и аэрации накапливают при культивировании в колбах до 7,2 г/л рибофлавина. В лабораторном ферментере при ведении процесса с подпиткой по способу [5] в культуральной жидкости накапливается до 12 г/л рибофлавина за 50-60 ч.

Новые штаммы получены с применением генетико-селекционных методов из исходного штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика 24/рМХ 45 и несут мутации с изменениями пуринового биосинтеза. Мутанты отбирали по признакам: устойчивость к аналогам пуринов 8-азагуанину и 6-меркаптопурину; адениновая ауксотрофность (АЗ) и реверсия к прототрофности (ST12). В результате были получены штаммы Bacillus subtilis Биоректор-1 АЗ (2159) и Биореактор-1 ST12 (2160), уровень продуктивности которых достигает 7,2 г/л в колбах и 12 г/л в ферментерах, что на 20-90% больше в сравнении с прототипом Bacillus subtilis ВНИИгенетика 24/рМХ45.

Получение рибофлавина с помощью штаммов Bacillus subtilis 2159 и 2160 осуществляют следующим образом: Полутора- или двухсуточную культуру, выращенную на косяке МПА, переносят в колбы с посевной средой, содержащей мелассу или сахарозу, биомассу дрожжей и минеральные соли. Посевной материал выращивают 12-20 ч при 37-40 o С в условиях аэрации и в количестве 1-5% передают в основную ферментационную среду. Можно засевать ферментационную среду, минуя стадию посевной среды смывом с косяка (титр клеток в ферментационной среде после засева 105. Ферментационная среда содержит в качестве источника углеводов глюкозу, или патоку, или сахарозу, или мелассу, в качестве ростовых факторов высушенную биомассу дрожжей, или дрожжевой экстракт, или пептон, или гидролизат казеина, источники минерального азота, например, мочевину, соли аммония, аммиачную воду, минеральные соли — соли магния, марганца, железа и др. Ферментацию осуществляют при температуре 37-43 o С при перемешивании и аэрации. Через 48-72 ч ферментации штаммов Биореактор-1 А3 (2159) и Биореактор ST12 (2160) в среде накапливается 5-7,2 г/л рибофлавина в колбах и 8-12 г/л в лабораторном ферментере.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 2-суточную культуру штамма 2159, выращенную в термостате при 37 o С на агаризованной среде МПА, содержащей 20 мкг/мл эритромицина, петлей переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, содержащие по 25 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды, мас.ч. сахароза 10, биомасса дрожжей 2, MgSO4 0,05; мочевина 0,6. Ферментацию осуществляют на качалке 240 об/мин при 40 o С в течение 72 ч. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 5 г/л.

Пример 2. Двухсуточную культуру штамма 2160, выращенную в термостате при температуре 37 o С на агаризованной среде МПА, содержащей 20 мкг/мл эритромицина, петлей переносят в колбы Эрленмейера, содержащие 25 мл ферментационной среды. Состав среды и условия ферментации, как в примере 1. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 7,2 г/л.

Пример 3. Двухсуточную культуру штамма 2159, выращенную в термостате при температуре 37 o С на скошенной агаризованной среде МПА с 20 мкг/мл эритромицина петлей переносят в посевную среду, разлитую по колбам Эрленмейера (750 мл) в количестве 50 мл. Состав посевной среды, мас. сахароза 2, биомасса дрожжей 1, сернокислый магний 0,05, мочевина 0,3. Через 16 ч культивирования в колбах на качалке при 37 o С производят засев ферментационной среды в лабораторном ферментере типа «Marubishi» объемом 1,2 л (начальный рабочий объем 0,7 л). Состав ферментационной среды, мас. биомасса дрожжей (БВК) 2, сернокислый магний 0,05, пеногаситель (ниоген) 0,1. После засева ферментацию осуществляют при аэрации (1:1), перемешивании (700-1000 об/мин), температуре 41±1 o С и постоянной подаче подпитки в виде раствора мелассы (концентрация около 50%) со скоростью около 2 г/л в час. Через 60 ч культивирования в среде накапливается 12 г/л рибофлавина.

Пример 4. Двухсуточную культуру штамма 2160, выращенную в условиях, как в примере 3 на посевной среде переносят в ферментационную среду, как в примере 3. Через 50 ч культивирования в среде накапливается 12 г/л рибофлавина.

Предлагаемые штаммы 2159 и 2160 на аналогичных прототипу средах обеспечивает уровень синтеза рибофлавина на 20-90% больше по сравнению с штаммом-прототипом ВНИИгенетика 24/рМХ45.

patents.google.com

Штамм бактерий bacillus subtilis — продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных -глюканазой

Использование: изобретение относится к биотехнологии, к производству ферментных препаратов, к сельскому хозяйству, к кормопроизводству ячменных кормов, используется в пищевой промышленности для пивоварения. Сущность изобретения: путем многократного рассева штамма B.subtilis ВКМП 13 5165 выделением и очисткой моноколоний на средах, содержащих в качестве источника питания лихенан, получен штамм B subtilis ВКПМ 5790. Штамм B. subtilis культивируют на питательной среде, содержащей пивную дробину, БВК, 1% KH2PO4, рН 6,8 7,2, температура культивирования 33 -37°С, длительность культивирования 266 32 ч. Культуральная жидкость имела следующие ферментативные активности: 1,3 1,4- β -глюканазу, 1,3 — 1,4- b -глюкозидазу, b -эндоглюканазу, 1,4 маннаназу, ксиланазу, ОЦА (общую цитолитическую активность) 20 30 ед/мл, a амилазу, глюкоамилазу, протеазу нейтральную, протеазу щелочную, протеазу кислую.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству комплексных ферментных препаратов, обогащенных β -глюканазой, используемых в сельском хозяйстве в кормопроизводстве ячменных кормов, в пищевой промышленности в пивоварении, а также во всех других случаях, связанных с переработкой ячменя.

По данным научно-технической литературы установлено, что эндосперм ячменя содержит гумми-вещества, 85% которых составляет β-глюкан, представляющий собой сложный комплекс некрахмальных полисахаридов. Приготовление ячменного корма в птицеводстве происходит наиболее эффективно при использовании комплексных ферментных препаратов, включающих наряду с β -глюканазой целлюлазы, гемицеллюлазы, протеазы и другие гидролитические ферменты, способствующие эффективному гидролизу ячменного сырья. Целлюлазы и гемицеллюлазы гидролизуют оболочку зерна ячменя, далее на алейроновый слой действуют протеазы, давая возможность β-глюканазе гидролизовать β-глюкан эндосперма. Фермент β-глюканаза расщепляет глюкановые блоки, в которые упакован крахмал, делая доступным его для пищеварительных ферментов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм B. subtilis, продуцент β -глюканазы (авт. св. СССР N 1507793, кл. С 12 N 9/42, 1991). Штамм B. subtilis (ВКПМ В-3936), описываемый в прототипе, выделен из почвы на среде с лихенином, и его культивирование производили на питательной среде следующего состава, г/л: нерастворимый крахмал 239,0; кукурузный экстракт 11,4; дрожжи пивные 2,2; лактоза 0,6; аммоний фосфорнокислый, 2-замещенный 8,4; CuSO4 0,0036; NaCl 0,28; MgSO4 0,15; K2SO4 2,9; CaCl2 0,45˙ Н2О до 1 л. Перед приготовлением среды крахмал предварительно осахаривают ферментом амилазой. Питательную среду стерилизуют при 125 о С, 30 мин, охлаждают и засевают суточной культурой. B.subtilis. Культивирование проводили в колбах и ферментере. Температура выращивания 37 о С, рН 6,5, число оборотов мешалки 180-2400 об/мин, длительность культивирования 48-72 ч. Активность β -глюканазы составила в культуральной жидкости в колбах 20,2 ед/мл, в ферментеpе 41,6 ед/мл.

Недостатками штамма-прототипа являются отсутствие биосинтеза других гидролитических ферментов, сопутствующих β-глюканазе и способствующих эффективному гидролизу полисахаридов ячменного сырья, большая длительность культивирования (48-72 ч), значительная зависимость интенсивности биосинтеза β -глюканазы от условий культивирования (активность β-глюканазы в культуральной жидкости в колбах, составила 20,2 ед/мл, а в ферментере 41 ед/мл).

Цель изобретения создание нового штамма продуцента β -глюканазы, позволяющего за счет присутствия в культуральной жидкости комплекса сопутствующих ферментов получить препарат, значительно более эффективно гидролизующий ячменное сырье, способного быстро расти на дешевой питательной среде, содержащей отходы, обладающего стабильностью процесса биосинтеза ферментов при переходе от лабораторных условий к промышленным.

Цель была достигнута путем многократного рассева штамма Bacillus subtilis (коллекционный номер ВКПМ В-5165), выделением и очисткой моноколоний на средах, содержащих в качестве источника питания лихенан, и путем обработки выделенных моноколоний температурой 100 о С в течение 25 с.

Полученный в результате новый штамм B. subtilis 5790 позволяет получить комплексный ферментный препарат. Полученный штамм депонирован в коллекции, коллекционный номер ВКПМ-В-5790.

Культуральная жидкость культуры Bacillus subtilis ВКПМ-В-5790 содержит следующие ферменты, (методы определения активностей приведены в конце описания): 1,3-1,4 β -глюканаза 60-70 ед/мл, 1,3-1,4 β-глюкозидаза 55-60 ед/мл, β -1,4 эндоглюканаза 4-6 ед/мл, β -1,4 маннаназа 8-10 ед/мл, ксиланаза 21-27 ед/мл, ОЦА (общая цитолитическая активность), 20-30 ед/мл. β -амилаза 15-20 ед/мл, глюкоамилаза 5-8 ед/мл, протеаза нейтральная 1-3 ед/мл, протеаза щелочная 550-630 ед/мл, протеаза кислая 3-5 ед/мл.

Морфология штамма. На МПА (мясопептонном агаре) форма колонии неправильная, морщинистая, мелкоскладчатая, внутренняя структура колонии мелкозернистая, профиль выпуклый, край колонии волнистый, цвет кремовый. На ККА (картофельно-казеиновом агаре) форма колонии ризоидная, плоская, форма края колонии лопастная, на выпуклой стороне край штриха выпукло-зубчатый, цвет колонии белый. Культура аэробная, растет при температуре 25-55 о С, оптимальная температура роста 33-37 о С, рН роста 5,5-8,5 рН оптимальное 6,8-7,8. Физиология питания: ассимилирует следующие источники питания: (углерода) рамнозу, арабинозу, мальтозу, сорбит, сахарозу, ксилозу, маннит, лактозу, галактозу, крахмал, лихенан, β-глюкан.

Ассимилирует следующие источники азота:
неорганические: (NH4)2 HPO4, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3,
органические: белки, аминокислоты, пептон, мочевину. В качестве источника углеродного и азотного питания потребляет природные субстраты: кукурузную муку, дробленый ячмень, пивную дробину, пшеничные отруби. Длительность культивирования штамма, необходимая для биосинтеза ферментов, 28-32 ч.

П р и м е р 1. Штамм В. subtilis 5790 выращивали в качалочных колбах, объемом 750 мл, с объемом среды 50 мл при температуре 33 о С в течение 32 ч на среде следующего состава: 2% пивной дробины (отход пивоваренного производства), 2% БВК (белково-витаминного концентрата), 1% КН2РО4 рН 7,2, воды до 50 мл. Стерилизация среды: 1 атм, 40 мин. Посевной материал: суспензия культуры бактерий, выращенной на агаризованной среде, содержащей мясопептонный бульон и лихенан. Количество посевного материала 2% от объема среды. Число оборотов качалки n 180 об/мин. Культуральная жидкость обладала следующими ферментативными активностями: 1,3-1,4 β -глюканаза 60 ед/мл, β-1,4 эндоглюканаза 4 ед/мл, 1,34-1,4 β -глюкозидаза 55 ед/мл, β- 1,4 маннаназа 8 ед/мл, ксиланаза 21 ед/мл, ОЦА 20 ед/мл, α-амилаза 15 ед/мл, глюкоамилаза 5 ед/мл, протеаза нейтральная 1 ед/мл, протеаза щелочная 550 ед/мл, протеаза кислая 3 ед/мл. Микроскопирование культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии.

П р и м е р 2. Штамм B. subtilis 5790 выращивали в ферментере объемом 10 л с валом и перемешивающим устройством из шести лопастей и c пеногасящим механическим устройством из двух лопастей, выгрузка культуральной жидкости производилась сжатым стерильным воздухом. Состав питательной среды: 2% пивной дробины, 1,5% БВК, 0,5% дробленого ячменя, 1% КН2РО4, воды до 5 л, рН-исходное 6,8. Количество посевного материала 2% от объема питательной среды. Аэрация: один объем воздуха на один объем культуральной жидкости. Число оборотов мешалки 220 об/мин. Длительность культивирования 30 ч, температура культивирования -35 о С. Культуральная жидкость обладала следующими ферментативными активностями: 1,3-1,4 β -глюканаза 65 ед/мл, 1,3-1,4 β-глюкозидаза 57 ед/мл, 1,4 β -эндоглюканаза, 5,0 ед/мл, 1,4 β-маннаназа 9,0 ед/мл, ксиланаза 24,0 ед/мл, ОЦА 25,0 ед/мл, α -амилаза 18 ед/мл, глюкоамилазаа 6,6 ед/мл, протеаза нейтральная 2 ед/мл, протеаза щелочная 600 ед/мл, протеаза кислая 4,0 ед/мл. Микроскопирование клеток культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии.

П р и м е р 3. Штамм B. subtilis-5790, выращивали в ферментере, объемом 250 л с валом и перемешивающим устройством, состоящим из закрытых турбин. Мешалка лопастная с лопастями расположенными в два яруса. В ферментере осуществлялось механическое перемешивание с барботажным подводом воздуха. Состав питательной среды: 2% пивной дробины, 1,5% БВК, 1,0% КН2РО4 воды до 100 л, рН исходное 7,8. Количество посевного материала 2% от объема среды. Температура культивирования, 37 о С, число оборотов мешалки 240 об/мин. Аэрация один объем воздуха на один объем культуральной жидкости. Длительность культивирования 28 ч. Микроскопирование клеток культуры в процессе культивирования показало, что морфология клеток без патологии. Культуральная жидкость имела следующие ферментативные активности: 1,3-1,4 β -глюканаза 70 ед/мл, 1,3-1,4 β -глюкозидаза 60 ед/мл. β -эндоглюканаза 6,0 ед/мл, 1,4 β-маннаназа 10 ед/мл, ксиланаза 27 ед/мл, ОЦА 30 ед/мл, α -амилаза 20 ед/мл, глюкоамилаза 8,0 ед/мл, протеаза нейтральная 3,0 ед/мл, протеаза щелочная 630 ед/мл, протеаза кислая 5 ед/мл.

Таким образом, преимущество предлагаемого штамма заключается в следующем:
способен синтезировать одновременно с β-глюканазой комплекс сопутствующих гидролитических ферментов, усиливающих эффективность гидролиза ячменного сырья;
способен потреблять в качестве источника питания отходы производства (пивную дробину), сохраняя способность биосинтеза глюканазы и сопутствующих ферментов;
отличается стабильностью процесса биосинтеза ферментов при переходе от лабораторных условий выращивания (колбы) к производственным в ферментерах;
имеет сравнительно небольшую длительность культивирования, которая обеспечивает максимальный биосинтез ферментов (28-32 ч).

Методы определения ферментативных активностей.

1.1,3-1,4 β -глюканазу определяли согласно оп. 59-00321-84 «Препарат ферментативный β-глюканаза высокоочищенная». За единицу β-глюканазной активности принимали такое количество фермента, которое способно образовывать в 1 мин из β -глюкана количество олигосахаридов, которое до восстанавливающей способности соответствует 1 мкМ глюкозы. Редуцирующие сахара определяли с 3,5 ДНС (динитро-салициловой кислотой).

2.1,3-1,4 β -глюкозидазу определяли по методу определения 1,3-1,4 β-глюканазы, с использованием в качестве субстрата лихенана
3.1,4 β глюканазу определяли по методике, описанной в журнале «Биоорганическая химия», 1977, т. 3. с. 405-414.

4.1,4 β -маннаназу (осахаривающую) определяли по методу, предложенному в Автореферате диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Власенко Е. Ф. М. 1990. За единицу активности β -маннаназы принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 40 о С и рН 5,8 способно образовывать из галактоманнана такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкМ маннаназы.

5. Ксиланазную активность определяли по ГОСТ 202.66-89 с использованием ксилана фирмы «Sigma».

6. ОЦА (общую цитолитическую активность) определяли согласно ОСТ 10.04.06.86. «Препарат ферментный циторизин ПХ».

7. Амилолитическую активность ( α-амилазу) определяли по ГОСТ 202. 64.4-89.

8. Глюкоамилазную активность определяли по ГОСТ 202.64.4-89.

9. Протеазу нейтральную, щелочную и кислую определяли по ГОСТ 202.662-74 «Препараты ферментные».

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПM-В-5790 продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных b -глюканазой.

Номер и год публикации бюллетеня: 18-1999

ОАО «Биотехнология», Автономная некоммерческая организация Научно-технический центр «ЛЕКБИОТЕХ»

Договор № 8394 зарегистрирован 26.03.1999

Извещение опубликовано: 27.06.1999

PC4A — Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 26-2000

Автономная некоммерческая организация Научно-технический центр «ЛЕКБИОТЕХ» (RU)

Договор № 9987 зарегистрирован 29.02.2000

Извещение опубликовано: 20.09.2000

Автономная некоммерческая организация Научно-технический центр «ЛЕКБИОТЕХ»

Некоммерческое партнерство Научно-технический центр «Лекарства и биотехнология»

Договор № 20075 зарегистрирован 13.09.2004

Извещение опубликовано: 27.10.2004 БИ: 30/2004

Договор № РД0007248 зарегистрирован 16.03.2006

Извещение опубликовано: 10.05.2006 БИ: 13/2006

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за
поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.04.2009

bankpatentov.ru

Смотрите еще:

  • Что нужно людям законы или 10 заповедей 10 Заповедей Закона Божьего. Толкование Заповедей. Грехи против 10 Заповедей 1. Аз есмь Господь Бог Твой: да не будут Тебе бози инии, разве Мене. 2. Не сотвори себе кумира и всякаго подобия, елика на небеси […]
  • Признания комиссара полиции прокурору республики Признание комиссара полиции прокурору республики (1971) ( Confessione di un commissario di polizia al procuratore della repubblica ) Дата выхода в России (или в Мире): 26.03.1971 Продолжительность: […]
  • Закон о санаторно курортном лечении Санаторно-курортное лечение В связи с вступлением в силу с 01.01.2005 Федерального закона от 22.08.2004 №122-ФЗ «О внесении изменений в законодательные акты Российской Федерации и признании утратившими силу […]
Закладка Постоянная ссылка.

Обсуждение закрыто.